茯砖茶“金花”的研究现状及其展望
湖南农业大学教授 蒋立文
【蒋立文，男，1968年出生，湖南农业大学食品科技学院学术委员会副主任，教授、博士生导师，食品科学与生物技术湖南省重点实验室主任，湖南省预防医学会食品卫生专业委员会常务委员，湖南省质量技术监督局食品安全专家。】
安化黑茶属黑茶类，因产自中国湖南安化县而得名。安化黑茶主要品种有“三尖”、“三砖”、“一卷”，其中茯砖茶由于制作过程中出现“金花”（冠突散囊菌）而备受关注，有关金花菌的分离、纯化、鉴定及其应用研究成为茶叶加工领域研究的热点。
湖南农业大学刘仲华教授等已在分子水平上充分证明茯砖茶中存在具有显著降脂减肥和降糖功能的特异成分，并发现了茯砖茶中独有的两种新的活性物质――茯茶素A和茯茶素B。日本研究茯砖茶的专家从茯砖茶中提取物质制成的保健品，售价超过黄金，因此有“黄金铂金不如黑金”之说。
冠突散囊菌（Eurotium cristatum），俗称“金花”，属于散囊菌目发菌科散囊菌属的一种真菌，可生长在土壤、茯砖茶、冬虫夏草、中药片、木屑等基物上。该种分布于中国、南非、以色列、瑞士、英国、美国等地。冠突散囊菌是小冠曲霉（Aspergillus cristatellus）的有性型。黑茶作为一种历史悠久的发酵食品，其发酵中微生物对茶叶品质、保健等发挥着重要的作用。下面就目前金花菌研究现状做一个总结。
茯砖茶中主要微生物分类研究现状及进展
近年来，随着显微技术和分子生物学、代谢组学等发展，在茯砖茶中优势微生物分离鉴定取得了一些重要进展。早在1941到1942年，徐国祯研究指出，将茯砖茶表面的“黄霉菌”初步鉴定为灰绿曲霉 (Aspergillus glaucus) [1]；1953年黄海化学工业研究所和中国茶业公司报道及1963年邓冠云研究结果均显示“金花菌”为灰绿曲霉(Aspergillus glaucus ) [2]。仓道平等根据“金花菌”的形态学特征将其鉴定为谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri)[3]，然而以上研究因为受到条件的限制，仅是通过依靠光学显微镜等形态学鉴定方法对菌落形态及菌丝结构作一般观察，所以其结论并不完全可靠。胡建程[4-5]、刘仲华[6]等分离得到了青霉(Penicillium)的Paladium变种、黑曲霉(Aspergillus niger)、灰绿曲霉(Aspergullus glauc)和黑根霉(Rhizopus nigricans)、米曲霉 (Aspergillus oryzae)和根霉菌(Rhizopus)、共头霉属 (Syncephalastrum)和竹丝霉属 (Dictyuchus)、毛霉属 (Mucor)、镰刀霉(Fusarien)和簇孢匍柄霉 (Stemphylium botryosum)等真菌。1990年，齐祖同与温琼英合作，按Raper&Fennell[7]专著中的方法对从临湘茶厂、白沙溪茶厂与湖南益阳茶厂生产的茯砖茶中分离纯化到的“金花菌”进行培养，并对其有性孢子进行电镜扫描，通过观察菌株子囊孢子的形态，在与模式菌株对比之后，最后确定该菌为灰绿曲霉群(Aspergillus glaucus group)的冠突曲霉 (Aspergillus cristatum)[8]。同年，按照应以菌株有性型为模式命名的原则，齐祖同对他们以前的命名进行了更正，认为其正确名称应是冠突散囊菌(Eurotium cristatum)[9]。但在1993年，刘作易等运用显微测定和电镜扫描技术，分析了来源于贵州桐梓茶厂和湖南生产的茯砖茶上不同“金花菌”菌株的生长发育特征以及分生孢子、子囊孢子的亚显微结构，并与齐祖同所分离的菌株以及模式菌株作了比较，研究结果均显示出该菌为灰绿曲霉组(Aspergillus glaucus group)谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri)的间型变种[10-12]。
随着分离鉴定技术发展，关注的不仅仅是发酵过程中的优势微生物，而是更加关注生产过程中微生态的演变规律，为茯砖茶健康发展提供依据。许爱清等[13]运用传统的分离培养技术和聚合酶链式反应—变性梯度凝胶电泳（PCR DGGE）技术研究获得了规模生产中茯茶发花过程的真菌菌群结构PCR DGGE指纹图谱，同时研究发现耐旱真菌散囊菌属和德巴利酵母属是茯茶“发花”过程中的优势真菌，并采用形态学特征鉴定方法和多位点序列分型（MLST）方法鉴定优势菌株为冠突散囊菌 (Eurotium cristatum)。黄浩等[14]从茯茶散茶中分离纯化到一株长势较好的“金花”菌，经鉴定为冠突散囊菌 (Eurotium cristatum)，并且研究表明茯茶“散茶发花”过程中冠突散囊菌参与生化成分复杂变化为品质的改善奠定了基础。胡治远等[15]研究表明，茯茶“渥堆”期间主要的微生物为酵母、黑曲霉、青霉与根霉，“金花”菌数量较少，但压砖后进入到“发花”阶段逐渐成为茯茶内的主导微生物，并确认“金花菌”为冠突散囊菌 (Eurotiμm cristatum)。龚雪[16]研究表明，整个“散茶发花”过程，除优势菌—冠突散囊菌快速增长外，黑曲霉、青霉、酵母和及少数其它霉菌的生长被强力抑制，这说明发酵过程中微生物之间的相互关系。陈云兰[12]、彭晓赟[17]等还报道有谢瓦氏散囊菌E.chevalieri L. Mangin、肋状散囊菌E. costiforme H.Z.Kong et Z. T. Qi、阿姆斯特丹散囊菌E. amstelodami L. Mangin、蜡叶散囊菌E. herbariorum (F.H. Wigg.)Link 等，这说明了黑茶发酵过程中真菌的多样性和复杂性。
王磊等[18]从广西和湖南产的黑茶砖茶中分离获得2株“金花菌”,均能在培养基上形成闭囊壳。根据分离菌株的培养特征和微观形态特征及β-微管蛋白基因(Ben A)、钙调蛋白基因(Ca M)及RNA聚合酶Ⅱ基因(RPB2)的系统发育分析,参照Hubka最新的曲霉属曲霉组Aspergillus section Aspergillus分类系统，将分离菌株分别鉴定为假灰绿曲霉A.pseudoglaucus及冠突曲霉A.cristatus。另外，通过扫描电镜记录了菌株A672闭囊壳的发育过程。在广西产砖茶中分离鉴定出的“金花菌”假灰绿曲霉为国内首次报道。通过比较，将过去湖南产砖茶中广泛报道的“金花菌”冠突散囊菌修订为冠突曲霉A.cristatus。
黑茶茶砖中“金花菌”的分离与鉴定对于黑茶品种的鉴别和质量评价具有重要指导意义。刘作易[10]在1993年就提出“金花”是黑茶品质优劣的重要指标的重要观点。湖南省关于黑茶的地方标准[19]也对金花的数量有明确的规定为30*104CFU/g。
从中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)保藏的菌种中，冠突散囊菌（Eurotium cristatum）有南京农大、中国微生物研究所等单位从茯砖茶、土壤、植物源等分离源获得已经命名的菌株19株。其中大部分从茯砖茶中获得，分离源产地主要来源于湖南益阳、安化等。而以“散囊菌”命名的微生物菌株有132株。阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）有24株，主要来自国外、土壤、发霉的纺织品、水果等。谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）有11株，仅CGMCC3.7929从茶砖中分离。肋状散囊菌（Eurotium costiforme）3株，匍匐散囊菌及其原变种（Eurotium repens var. repens）24株，从茶叶分离3株。赤散囊菌（Eurotium rubrum）19株，从中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection, CICC)系统中查到只有两株以冠突散囊菌（Eurotium cristatum）命名的菌株，CICC2650中研究表明，通过该微生物的发酵使得茶汤的澄清度，亮度得到较高提升，并产生了特殊的菌花香气，有研究表明该菌发酵能够产生特异的酵素成分，如茯茶素。CICC41041由黑龙江轻工研究院转自中国微生物研究所分离所得，其特点是子囊果裸露，混生于黄色或红色的菌丝丛中，子囊果壁由大而多角的细胞组成。而以散囊菌命名的微生物菌株共9株，4株来源于酿酒中丢糟中获得，两株为双望木镜分离物及光学显微镜防霉实验菌。
专利申报情况：以“黑茶+冠突散囊菌”结合查询了36个国家发明专利，“黑茶”作为关键词搜索的专利有1153条，“冠突散囊菌”为关键词搜索到的国家发明专利有174条。以“茯砖茶”为关键词生产的专利有206个，以“安化黑茶”为关键词搜索得到的专利有58个(包装13个)。
冠突散囊菌在茯砖茶发酵过程中主要代谢产物研究现状
王增盛等[20, 21]研究发现茯茶在“发花”后含氮量比原料提高了28%，儿茶素各组分均呈下降趋势，咖啡碱变化幅度很小，而含量较低的可可碱和茶碱变化幅度较大，但这三种嘌呤碱的总量变化很小。刘仲华等[22]利用分光光度法和薄层色谱法分析发现“发花”过程中类胡萝卜素的主要组分叶黄素和β-胡萝卜素及叶绿素的深色降解产物脱镁叶绿酸酯a、b 呈明显增加，并随着冠突散囊菌的数目呈现同步变化，由此认为，色素的变化与此微生物代谢活动有关。傅冬和等[23]研究表明，茯茶发酵过程中几种主要化学成分含量在“发花”工序各成分含量下降最快，其中儿茶素、黄酮类及茶多酚总量减少最多，可溶性糖及水浸出物变化不大。
Wu 等[24]研究发现，茯茶“发花”前后茶多酚、儿茶素和氨基酸降低约20%，而有机酸和茶多糖则显著升高，丙酮酸、苹果酸、乳酸、醋酸和柠檬酸，“发花”后成为茯茶中主要有机酸成分。黄浩等[25]研究茯茶“散茶发花”加工过程中不同原料中的茶多酚、儿茶素、黄酮类、可溶性糖、粗纤维等的含量均有不同程度的下降，多糖的含量有小幅度的增加；在5d的发花期间，冠突散囊菌繁殖增长较快，第3d进入对数生长期，随后增长速率逐渐放缓直至发花结束。邓放明[26]采用冠突散囊菌以0.8%黑茶浸提液加6%的蔗糖进行液体发酵，发现在液体发酵过程中氨基酸含量呈先下降后回升的变化，但总体呈下降趋势，发酵液中茶多酚、儿茶素总量明显下降，各组分儿茶素和茶黄素在不同发酵时期其含量有波动，但总趋势是儿茶素和茶黄素减少，茶褐素大量增加。
黑茶发酵过程中酶的变化及影响因素
黑茶发酵过程中的“发酵”实际上包括两个方面的层次，一是茶叶本身内源酶的作用，包括多酚氧化酶、过氧化氢酶等；二是微生物生长过程中形成的诸如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、单宁酶等。
刘仲华等[27]运用聚丙烯凝胶电泳技术对黑毛茶初制过程中“渥堆”工序的多酚氧化酶谱进行分析，发现随着渥堆时间的延续，酶带不断变化，产生与鲜叶不同的酶谱，而无菌渥堆的酶谱没有新的酶带产生，说明多酚氧化酶的同工酶组分来自于微生物的胞外酶；同时发现渥堆期间纤维素酶活性和果胶酶活性增加幅度较大，蛋白酶活性相对较低；渥堆中多酚氧化酶、纤维素酶和果胶酶活性与真菌类数量变化存在相当高的关联性；酸性蛋白酶活性的高低仅与真菌类的黑曲霉有较强的关联度。
黄建安等[28]运用酶分析技术研究了茯茶制造中多酚氧化酶同工酶、纤维素酶和果胶酶活性的变化，研究发现该3 种酶均存在于茯茶制造中，且在发花时呈现规律性的变化。添加诱发剂对发花中3种酶的活性有不同程度的增益效应，并且改变了多酚氧化酶同工酶谱及其活性，相应的同工酶提前出现，对改善茯茶的品质有积极的作用。何红霞[29]对“散茶发花”过程微生物酶活性变化进行研究，发现散茶发花过程中的纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶以及单宁酶共六种酶的活力均由低到高变化且与微生物数量变化呈高度相关。蔡正安等[30]研究发现冠突散囊菌所产生的纤维素酶酶活性最佳温度是50℃，最佳pH 值是4.8；在30~50℃，pH4~6 范围内有较高的稳定性；Ca2+、Mg2+离子对酶活性有激活作用，Mn2+、Zn2+、Pb2+离子对酶活有抑制作用。丁婷等[31]研究发现“金花”菌所产蛋白酶以中性和碱性蛋白酶为主，最适碳源为乳糖，氮源为麸皮，最适无机盐为氯化钠；在此条件下“金花”菌产中性蛋白酶的酶活性可达到237 U/g，产碱性蛋白酶的酶活性可达236U/g。而有关发酵后功能性发生变化如抗氧化活性、增强防止脉粥样硬化能力、抗菌及抗肿瘤作用等不再重复。
代谢组学在研究发酵产品中的应用研究
发酵产品核心是微生物及其酶的作用，当然也包括特定的工艺，这和传统酿造食品非常类似。由于传统发酵食品的微生物群落的多样性，发酵食品的生产过程涉及物理、化学甚至生物学之间的交互性，代谢产物的复杂性，发酵环境的多变性，实际上研究传统发酵食品各种变化很难达到一定的高度，于是代谢组学应运而生使得对复杂发酵过程的系统分析或控制成为可能。代谢组学（Metabolomics）是以定性和定量限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分为目标，以系统生物学的观点集中阐释生物体代谢反映的全部信息，为发现生物标志物、进一步阐明机理提供了新的方法和思路。所以代谢组学比传统单一指标的检验分析方法更具系统性。同时高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC MS/MS）和高效液相色谱-核磁共振联用技术（HPLC NMR）相结合能在未获得未知化合物纯品的情况下，得到未知化合物的UV、NMR、MS 信息，为未知化合物分析提供了全面的信息。
代谢组学在传统发酵食品研究中发挥重要的作用。Himmelreich 等[32]应用13C NMR 技术对酿酒酵母代谢物进行分析，发现了甘氨酸分解代谢新途径。Choi 等[33]以HNMR 技术为基础，利用代谢组学研究方法对韩国豆酱的生产过程进行了实时检测，通过结合主成分分析确定发酵过程中糖含量下降，乙酸、酪氨酸、苯丙氨酸等含量增加主要是发酵时间不同所致。Weckx S 等[34]研究了黑麦在10 d内3个阶段的自然发酵过程中菌相和组分的变化情况，利用非靶标技术发现了在发酵过程各阶段可能与一些微生物活动相关的标记物。梁恒宇[35]对5 株酿酒酵母分别进行葡萄酒发酵试验，利用基于NMR 和气相色谱-质谱联用（GC MS）的代谢组学技术监控发酵过程，发现葡萄酒酿造过程可明显分为3 个阶段，并得到其不同阶段各菌株所酿葡萄酒组分差异的主要标记物，为葡萄酒酿造工艺调控提供了理论方向。LeVan Diep [36]利用基于NMR 和GC MS 的代谢组学技术对汾酒大曲培养过程中各阶段的代谢组分进行了跟踪监测，揭示了清香型大曲（汾酒大曲）培养过程中各阶段大曲中的标记物，且各培养阶段可用乙酸、丙氨酸、精氨酸、甜菜碱、胆碱、乙醇、果糖、葡萄糖、乳酸、甘露醇等标记物来区分，挥发性香气成分也有类似的规律，该研究为传统发酵食品的过程控制提供了理论基础。
另外，发酵食品的产物具有不确定性，微生物种类及微生物生态复杂变化，不同发酵阶段微生物不同，酶系分析不同，代谢产物差异很大。值得一提的是：微生物多样性，微生物之间协同拮抗等多重作用，主要代谢产物包括主要成分转化和风味形成极其复杂，因此采用现代技术分析代谢过程中代谢产物很有必要。利用HPLC-NMR、HPLC-MS、ESI、 MS/MS、LCQ等多种现代分析技术有机结合去鉴定降解产物或新形成产物，再去探求其合成途径，探求底物、微生物酶、反应条件的相关性，这是下一步研究的重要方向。刘仲华教授鉴定茯茶素1和茯茶素2，证明已经在这方面取得成功的经验， 傅冬和[37]通过综合运用柱色谱、红外、紫外、质谱、核磁共振、高效薄层及高效液相色谱等技术手段，从茯茶中分离确定8 个化合物分别为：没食子酸、没食子儿茶素(GC)、3-甲氧基-4,5-二轻基苯甲酸、3,4-二轻基苯甲酸、表没食子酸儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)及芦丁。Ling 等[38]通过传统分离纯化技术手段结合红外、核磁、液质联用等从茯茶中分离鉴定了3 个新的萜烯类化合物。Lee 等[39]通过基于核磁共振（1H NMR）和主成分分析（PCA）的代谢组学方法研究了绿茶发酵过程中茶叶内含成分的变化，揭示了绿茶发酵过程中与发酵成熟相关的14 种标记物，为研究绿茶的发酵过程调控提供了可靠的理论基础。茯砖茶是一种很好的发酵产品，采用代谢组学进行研究是非常必要的和有效的。
存在的问题与下一步研究发展的方向
建立茯砖茶发酵体系的优势微生物资源库：从已经研究得到的结果来看，黑茶发酵过程中存在大量的有益微生物，对黑茶功能活性成分增加起到非常重要的作用。资源库的建立可以有利于探索黑茶发酵过程中进行微生态的动态变化规律，探索各微生物的作用机理和功能，区分其有益还是需要控制的微生物等等，同时动态发酵过程也是微生物彼消我长的过程，对发酵过程中微生物变化和物质变化联系起来进行控制，可为生产产品质量安全控制和鉴定提供重要依据。同时资源库的建立有利于有效保障产品的特异性和差异性。
建立以纯种发酵为主的现代发酵技术改良传统“发花”工艺：优势微生物对茯砖茶品质形成具有决定性作用，为进一步提升黑茶产品的技术含量和核心竞争力，确保优势微生物最佳发酵转化条件，建立多菌种混合发酵的稳态化发酵技术体系，保障产品质量和安全。强调利用现代生物技术改良传统生产工艺不是一味求所谓“快速发酵”，但求品质稳定和安全；也可以根据区域优势微生物不同，形成产品品质差异化，寻求健康有序发展。
利用代谢组学进一步研究发酵过程中主要核心物质的动态变化：采用HPLC MS/MS 和HLC NMR 联用技术对发酵前后茶叶化学组成变化进行分析，筛选发酵前后茶叶样品的差异代谢物，明确特征代谢物的底物来源及可能的生物合成途径，以期探明茯茶中冠突散囊菌作用下的代谢物变化及其形成机理。同时将有效转化产物进行生理活性鉴定，构建茶叶基础上新物质的结构-功能的构效关系，为进一步开发更高附加值的茶产品奠定坚实的物质基础和理论基础。
形成特色的区域资源优势和技术内涵：安化黑茶有其独特的发展历史和资源优势、地域优势、加工区域优势，俗话说“一方水土养一方人”，要使产业实现可持续发展，强化对本地资源优势的保护是十分必要的，如茶叶品种的原地产保护、自然环境中天然野生茶资源的开发，同时将微生物资源、特色加工工艺和冰渍岩等地理地质条件联系起来，形成独特的区域性极强的文化特色和消费特色、地域特色，形成安化黑茶特有的文化技术内涵，提升安化黑茶品味，这将有十分重要的战略意义。
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原载《安化黑茶》杂志2016年第5期总第12期